1.引言

1.1 CAR-T療法

CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T Cell Immunotherapy）指的是嵌合抗原受體T細(xì)胞療法?？梢院?jiǎn)單理解為提取患者T細(xì)胞在體外進(jìn)行基因工程改造，借助病毒載體將具有腫瘤細(xì)胞識(shí)別和T細(xì)胞激活能力的嵌合抗原受體整合到T細(xì)胞表面，從而精準(zhǔn)殺傷腫瘤細(xì)胞的新型靶向腫瘤療法，近年來(lái)通過(guò)優(yōu)化改良在臨床腫瘤治療上取得很好的效果，是一種非常有前景的，能夠精準(zhǔn)、快速、高效，且有可能治愈癌癥的新型腫瘤免疫治療方法。

1.2慢病毒載體（Lentiviral Vector， LV）

慢病毒載體（Lentiviral Vector， LV）是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，并可以在體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。

慢病毒載體是CAR-T中最常使用的病毒載體，例如美國(guó)已經(jīng)上市的兩個(gè)靶向CD19的CAR-T藥品，諾華的Kymriah和凱特的Yescarta，均采用慢病毒載體。國(guó)內(nèi)申報(bào)IND并受理的細(xì)胞免疫治療項(xiàng)目絕大部分也選用了慢病毒載體作為感染T細(xì)胞的載體。

CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)環(huán)節(jié)中包括以攜帶目的基因的慢病毒載體感染T細(xì)胞，其中慢病毒的滴度對(duì)感染是否成功非常關(guān)鍵。

由于慢病毒載體由蛋白質(zhì)和核酸組成，導(dǎo)致其儲(chǔ)存條件遇到了與其他生物制品類似的局限性。比如通常無(wú)法在常溫及4℃冷藏條件下長(zhǎng)時(shí)間保存，熱穩(wěn)定性差，同時(shí)反復(fù)凍融也會(huì)降低其滴度。

目前尚無(wú)理想的慢病毒載體凍存保護(hù)液，-80℃冷凍保存或加入甘油保護(hù)劑也不能有效防止慢病毒載體在儲(chǔ)存過(guò)程中滴度降低。此外慢病毒載體在運(yùn)輸時(shí)需要采用低溫冷鏈運(yùn)輸，增加了運(yùn)輸成本，且無(wú)法規(guī)避運(yùn)輸帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。

1.3冷凍干燥

冷凍干燥（Lyophilization）全稱真空冷凍干燥，簡(jiǎn)稱凍干，是在低溫減壓條件下，利用水的升華使制品低溫脫水而達(dá)到干燥的一種技術(shù)。凍干在低溫低氧條件下進(jìn)行，多數(shù)生物反應(yīng)停滯，且處理過(guò)程無(wú)液態(tài)水存在，使物料原有結(jié)構(gòu)和形狀得到最大程度的保護(hù)。通過(guò)凍干獲得的粉體硬團(tuán)聚少，粒徑小且均勻，已經(jīng)成為制備生物制品，尤其是蛋白多肽類粉針劑的一種重要方法。

2.研究目標(biāo)

該研究旨在利用凍干技術(shù)，選取慢病毒載體，探索出適合病毒類載體儲(chǔ)存的凍干保護(hù)劑型，同時(shí)制備得到新型的慢病毒載體凍干制劑，通過(guò)篩選慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方，并以正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）的方法進(jìn)行處方優(yōu)化，制備得到外觀良好、生物滴度高的慢病毒載體凍干制劑，使得該制劑在常溫下具有較長(zhǎng)的保質(zhì)期，并且能夠在高溫高濕的條件下依然保持較高的生物活性。

3.研究結(jié)果

3.1慢病毒載體凍干制劑制備的可行性分析

使用流式細(xì)胞（FACS）和實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)（QPCR）的方法考察慢病毒載體的生物滴度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

比較凍干保護(hù)劑與HBSS對(duì)于慢病毒載體在–80 ℃ 凍存以及凍干過(guò)程中的影響，同時(shí)對(duì)比凍存前后以及凍干前后對(duì)慢病毒滴度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在凍干的過(guò)程中，凍干保護(hù)劑確實(shí)能夠起到保護(hù)作用，最終兩種檢測(cè)方法均測(cè)得滴度回收率。通過(guò)這兩種檢測(cè)方法可以看出慢病毒載體凍干制劑制備具有可行性。

3.2慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方的篩選

為篩選適用于慢病毒載體的凍干保護(hù)劑處方，從菌種凍干、脂質(zhì)體凍干、蛋白質(zhì)凍干(包括減毒活疫苗類)、其他病毒類凍干（腺病毒等）選定了5組基本的凍干保護(hù)劑（含1組對(duì)照組）進(jìn)行研究分析：

采用以上5組處方進(jìn)行慢病毒載體凍干保護(hù)劑處方篩選，以凍干產(chǎn)品的外觀、色澤和復(fù)溶性為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)其理化性質(zhì)，考察了各種凍干保護(hù)劑對(duì)凍干產(chǎn)品的保護(hù)作用，結(jié)果見(jiàn)下表：

5組凍干保護(hù)劑處方的慢病毒載體滴度回收率結(jié)果如圖2所示。

從圖2(a)中可以看出，Ⅱ組的凍干保護(hù)劑處方保護(hù)效果最佳，加入Ⅱ組的凍干保護(hù)劑處方后制備得到的慢病毒載體凍干制劑，感染細(xì)胞后通過(guò)QPCR的方法檢測(cè)得到的滴度值最高；圖2(b)顯示，Ⅱ組慢病毒載體的滴度回收率最佳，兩圖相符合，無(wú)論在冷凍保存條件下還是在真空冷凍干燥后，Ⅱ組的凍干保護(hù)劑的效果均最好，所以選擇以Ⅱ組保護(hù)劑為基礎(chǔ)進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)多響應(yīng)預(yù)測(cè)結(jié)果，確定最優(yōu)的凍干保護(hù)劑處方為15g海藻糖、8.9mg L-丙氨酸、15.5mg L-組氨酸、1.0 mg CaCl2、0.76 mg MgSO4。

3.3慢病毒載體凍干制劑穩(wěn)定性研究

使用QPCR檢測(cè)慢病毒載體凍干制劑和凍存制品的生物滴度 (IU/mL)，對(duì)生物滴度值取lg 對(duì)數(shù)函數(shù)，以lgT對(duì)時(shí)間t做圖，結(jié)果可參見(jiàn)圖4。

結(jié)果表明，慢病毒載體在冷凍干燥以后可以實(shí)現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的保存，但是生物滴度值會(huì)下降，說(shuō)明在儲(chǔ)存時(shí)也會(huì)緩慢失活。但是在4 ℃及23℃保存的條件下慢病毒載體凍干制劑均更加穩(wěn)定（圖4a及圖4c），凸顯了其儲(chǔ)存優(yōu)勢(shì)。

使用QPCR檢測(cè)慢病毒載體凍干制劑和凍存制品反復(fù)凍融后的生物滴度(IU/mL)，結(jié)果可參見(jiàn)圖5。

可以看出反復(fù)凍融對(duì)于慢病毒載體凍干制劑的影響并不明顯，隨著反復(fù)凍融次數(shù)的增加，慢病毒滴度能維持穩(wěn)定；然而對(duì)于慢病毒載體凍存制劑而言，反復(fù)凍融的影響顯著，表明慢病毒凍干制劑在反復(fù)凍融的條件下更加穩(wěn)定，可以實(shí)現(xiàn)反復(fù)凍融5~6次，顯著改善了液體制劑反復(fù)凍融導(dǎo)致的活性損失等問(wèn)題。

4.討論與總結(jié)

4.1凍干保護(hù)劑的選擇

凍干保護(hù)劑主要可分為以下幾類：一般為多羥基化合物、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、聚合物和無(wú)機(jī)鹽等化合物。因?yàn)閮龈杀Ｗo(hù)劑不但要具有保護(hù)生物制品活性的效果和結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，而且要具有凍干賦形的作用。

糖是一種使用最廣泛的凍干保護(hù)劑，本研究中采用的海藻糖屬于二糖，比蔗糖具有更低的吸濕性和更高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度，其羥基能替代水分子與蛋白質(zhì)分子表面部分結(jié)合，而且海藻糖分子較小，能填充到蛋白質(zhì)分子的空隙中，有效地限制蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在凍干時(shí)可以對(duì)慢病毒的蛋白衣殼形成保護(hù)，因此凍干制劑保護(hù)效果更好。

此外，需要指出的是，某些糖類輔料可能降解，對(duì)蛋白穩(wěn)定性造成不利影響。例如，蔗糖會(huì)水解成葡萄糖和果糖，形成還原糖，從而導(dǎo)致賴氨酸殘基的蛋白糖化。據(jù)報(bào)道，這些糖化反應(yīng)甚至在凍干蛋白制劑的儲(chǔ)存過(guò)程中以固態(tài)發(fā)生。相比之下，不具有還原性、高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、高酸堿穩(wěn)定性、天然雙糖中最穩(wěn)定的海藻糖，作為保護(hù)劑正獲得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

氨基酸具有酸性羧基和堿性氨基，能夠調(diào)節(jié)制品溶劑環(huán)境的pH值，不同類別的氨基酸具有不同的親水性功能，而親水性強(qiáng)的氨基酸較易與蛋白質(zhì)產(chǎn)生氫鍵，這對(duì)蛋白質(zhì)在凍干的過(guò)程中的穩(wěn)定性和活性具有重要的保護(hù)作用，如組氨酸、丙氨酸等，可以增加慢病毒載體包膜蛋白和組氨酸磷酸鹽緩沖液間的張力，提高慢病毒載體包膜蛋白水化水平。而加入二價(jià)陽(yáng)離子類，如CaCl2和MgSO4這兩種無(wú)機(jī)鹽，可延遲海藻糖結(jié)晶，通過(guò)和磷酸根陰離子存在下氫鍵網(wǎng)絡(luò)以及分子遷移率的變化抑制結(jié)晶。

4.2總結(jié)

該研究給出了一種新型的慢病毒載體凍干制劑的制備方法。通過(guò)研究?jī)龈杀Ｗo(hù)劑的組分篩選與優(yōu)化、凍干產(chǎn)品的制劑學(xué)研究和穩(wěn)定性研究，表明凍干技術(shù)對(duì)于慢病毒載體的儲(chǔ)存帶來(lái)了新的突破。

在最優(yōu)凍干保護(hù)劑處方的條件下，慢病毒載體凍干制劑能夠?qū)崿F(xiàn)儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、運(yùn)輸過(guò)程簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性提高的優(yōu)點(diǎn)，為CAR-T細(xì)胞免疫治療的進(jìn)一步推廣提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

這其中，作為凍干保護(hù)劑主要成分的海藻糖發(fā)揮著不可替代的作用，提示海藻糖作為一種新興的凍干保護(hù)劑具有廣闊的應(yīng)用前景與市場(chǎng)價(jià)值。艾偉拓長(zhǎng)期穩(wěn)定供應(yīng)注射級(jí)海藻糖，超低內(nèi)毒素，符合各國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，助力產(chǎn)品中外申報(bào)！